病毒滴度是衡量病毒感染性強弱的核心指標，直接影響病毒學基礎研究及疫苗研發的準確性與可靠性。病毒滴度測定的關鍵前提是獲得高質量、高純度的病毒核酸，其提取效率與純度直接決定后續qPCR、數字PCR等檢測方法的靈敏度與重復性。
傳統病毒核酸提取依賴手動操作，存在操作步驟繁瑣、耗時較長（單次提取需40~60min）、人為誤差大、易交叉污染等問題，尤其在疫苗研發的批量樣本（如發酵液、純化中間品）檢測中，難以滿足高效、標準化的需求。博清生物科技（南京）有限公司研發的核酸提取儀基于磁珠法原理，整合樣本裂解、核酸結合、洗滌、洗脫全流程自動化操作，具有提取效率高（單次可處理96份樣本，耗時<25min）、操作標準化、污染風險低等優勢，但該儀器在病毒滴度測定場景中的應用效果尚未系統驗證。
一、材料與方法
（一）實驗材料
1、儀器：博清生物核酸提取儀；實時熒光定量PCR儀；高速離心機。
2、病毒樣本：SARS-CoV-2病毒株；甲型流感病毒H1N1株；重組腺病毒Ad5-EGFP株，均經Vero細胞培養擴增，病毒液濃度梯度為101~10?TCID50/mL。
3、試劑：磁珠法病毒核酸提取試劑盒；酚-氯仿-異戊醇混合液；SuperScript III One-Step qRT-PCR Kit；SARS-CoV-2 ORF1ab基因引物探針、H1N1 HA基因引物探針、Ad5 E1A 基因引物探針。
4、標準品：SARS-CoV-2 RNA標準品。
（二）實驗方法
1、病毒樣本預處理
取各病毒液（101~10? TCID50/mL），每濃度梯度設3個重復，4℃下8000×g離心10min，去除細胞碎片，取上清液作為核酸提取樣本，體積均為 200μL。
2、核酸提取
試驗組（博清生物核酸提取儀）：按照儀器操作說明書，將200μL病毒上清液與20μL蛋白酶K、200μL裂解液混合，加入儀器樣本孔，選擇“病毒核酸提取程序”（裂解溫度56℃，時間10min；洗脫體積50μL），自動完成提取，收集洗脫液即為病毒核酸。
對照組（傳統手動酚-氯仿法）：取200μL病毒上清液，加入200μL酚-氯仿-異戊醇混合液，渦旋振蕩5min，12000×g離心10min，取上層水相；加入等體積異丙醇沉淀核酸，-20℃靜置30min，12000×g離心15min，棄上清；75%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后用50μL無酶水溶解，即為病毒核酸。
3、核酸質量檢測
采用超微量分光光度計測定核酸濃度（ng/μL）及純度（A260/A280比值，合格范圍1.8~2.0）；每個樣本重復檢測3次，計算均值與標準差（SD）。
4、病毒滴度測定（qPCR法）
qPCR反應體系：20μL體系，含SuperScript III酶混合液10μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8μL、探針（5μmol/L）0.4μL、病毒核酸模板2μL、無酶水6μL。
qPCR反應條件：逆轉錄階段50℃ 30min；預變性95℃ 2min；擴增階段95℃ 15s、60℃ 30s，共40個循環，收集熒光信號。
滴度計算：以SARS-CoV-2 RNA標準品繪制標準曲線（CT值與拷貝數對數的線性回歸方程），根據樣本CT值計算病毒核酸拷貝數；結合病毒培養體系體積與稀釋倍數，換算為病毒滴度（TCID50/mL），公式參考Reed-Muench法。
5、數據分析
采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量數據以“均值±SD”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson相關系數；P<0.05表示差異有統計學意義。
二、結果
（一）核酸提取效率與純度對比
試驗組對3種病毒樣本的核酸提取濃度均顯著高于對照組（P<0.01），且A260/A280比值更接近理想范圍（1.8~2.0），無明顯蛋白或有機溶劑污染。其中，SARS-CoV-2樣本的提取濃度提升最顯著，試驗組均值（302.4ng/μL）較對照組（201.7ng/μL）提高50.0%。
（二）核酸提取重復性分析
試驗組對同一濃度病毒樣本（10? TCID50/mL）的3次重復提取中，核酸濃度的CV值均 <4.2%，顯著低于對照組（CV>7.5%）；qPCR檢測的CT值變異系數同樣表現更優，試驗組CV均<3.8%，對照組CV>6.9%，表明博清生物核酸提取儀的操作標準化程度更高，重復性更穩定。
（三）病毒滴度測定結果對比
兩種方法測定的病毒滴度呈強正相關（R2=0.986，P<0.001），但試驗組測定結果更接近標準品參考值。以SARS-CoV-2 10? TCID50/mL標準樣本為例，試驗組測定值為（9.8±0.3）×103 TCID50/mL，誤差僅2.0%；對照組測定值為（8.2±0.5）×103 TCID50/mL，誤差達18.0%，表明博清生物核酸提取儀可提升病毒滴度測定的準確性。
三、討論
本研究從核酸提取效率、重復性及滴度測定準確性三個核心維度，驗證了博清生物核酸提取儀在病毒學研究與疫苗研發中的適用性，其優勢主要體現在以下三方面：
（一）高效提取與高純度核酸：博清生物核酸提取儀采用磁珠法特異性結合病毒核酸，配合自動化裂解與洗脫程序，避免了傳統酚-氯仿法中有機溶劑殘留、蛋白污染等問題，使核酸純度（A260/A280≈1.89）更符合qPCR檢測需求；同時，儀器單次提取耗時<25min，且支持96份樣本批量處理，顯著提升疫苗研發中批量樣本（如發酵液、純化中間品）的檢測效率。
（二）穩定的重復性：傳統手動提取依賴操作人員的技術熟練度，易因加樣誤差、離心時間差異等引入人為干擾；而博清生物儀器通過標準化程序控制溫度、轉速、試劑加樣量等關鍵參數，使核酸濃度與qPCR CT值的CV均<4.2%，滿足疫苗生產中“批次一致性”的質控要求。
（三）準確的滴度測定結果：病毒滴度測定的準確性依賴核酸提取的完整性——博清生物儀器的裂解緩沖液可高效破壞病毒衣殼，釋放RNA/DNA，減少核酸降解；結合其高提取效率，使qPCR檢測的靶基因拷貝數更接近實際病毒量，滴度測定誤差<5%，顯著優于傳統方法（誤差>15%），為疫苗抗原含量標定、病毒致病機制研究提供可靠數據。
本研究的局限性在于未涉及復雜基質樣本（如含血清的病毒培養上清）的提取效果，后續可進一步驗證儀器在臨床樣本或疫苗生產復雜基質中的應用性能。此外，博清生物核酸提取儀可與qPCR儀聯動，構建“提取-檢測”一體化流程，未來可探索其在病毒快速診斷與疫苗應急研發中的應用潛力。
博清生物科技（南京）有限公司研發的核酸提取儀可高效、穩定地完成SARS-CoV-2、甲型流感病毒、重組腺病毒等多種病毒的核酸提取，其提取的核酸濃度高、純度優，且重復性顯著優于傳統手動方法。該儀器可通過提升核酸提取質量，保障后續qPCR檢測的準確性，進而實現病毒滴度的精準測定，適用于病毒學基礎研究、疫苗研發及生產質控等場景，具有較高的推廣應用價值。
