病毒分離是病毒學(xué)研究的核心環(huán)節(jié)，而高質(zhì)量病毒核酸的提取是后續(xù)病毒基因擴(kuò)增、序列分析、抗原檢測(cè)及病毒致病性研究的前提。傳統(tǒng)病毒核酸提取方法（如酚-氯仿法、離心柱法）存在操作步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、試劑污染風(fēng)險(xiǎn)高、提取效率受人為因素影響大等問(wèn)題，尤其在處理批量樣本或低載量病毒樣本時(shí)，難以滿足科研實(shí)驗(yàn)的時(shí)效性與穩(wěn)定性需求。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀基于磁珠法原理，整合樣本裂解、核酸結(jié)合、洗滌、洗脫全流程自動(dòng)化操作，可同時(shí)處理1~16份樣本，且具備封閉式提取通道以降低交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)對(duì)比該儀器與傳統(tǒng)方法在不同類(lèi)型病毒樣本中的核酸提取效果，驗(yàn)證其在病毒分離科研場(chǎng)景中的適用性，為病毒學(xué)研究提供高效的核酸提取技術(shù)方案。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器：博清生物核酸提取儀；超微量分光光度計(jì)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；瓊脂糖凝膠電泳儀。

2、病毒樣本：SARS-CoV-2滅活樣本；甲型流感病毒 H1N1亞型培養(yǎng)物；人腺病毒AdV-5型培養(yǎng)物。

3、試劑：博清生物磁珠法病毒核酸提取試劑盒；傳統(tǒng)酚-氯仿核酸提取試劑；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；SARS-CoV-2、H1N1、AdV-5特異性熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒；瓊脂糖。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、樣本預(yù)處理

所有病毒樣本均按照以下步驟預(yù)處理：取200μL樣本（鼻咽拭子樣本需先經(jīng)12000rpm 離心5min，取上清），加入20μL蛋白酶 K（20mg/mL），56℃孵育10min 以裂解病毒顆粒，待后續(xù)核酸提取。

2、核酸提取操作

博清生物組：按照儀器說(shuō)明書(shū)，將預(yù)處理后的樣本、提取試劑盒中的裂解液、磁珠液、洗滌液及洗脫液依次加入16孔提取板，設(shè)置提取程序，洗脫體積為50μL，完成后收集洗脫液即為病毒核酸樣本。

傳統(tǒng)酚-氯仿組：取預(yù)處理樣本，加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:1），振蕩10min 后12000rpm離心10min，取上層水相；加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸，-20℃靜置30min后12000rpm離心15min，棄上清；用75%乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干后用50μL無(wú)酶水溶解，即為核酸樣本。

3、核酸質(zhì)量檢測(cè)

濃度與純度：使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)核酸樣本的濃度（ng/μL）及A260/A280比值，A260/A280在 1.8~2.0視為純度合格。

完整性：配制1.5%瓊脂糖凝膠，加入核酸樣本10μL及Loading Buffer 2μL，120V電泳30min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察核酸條帶，無(wú)彌散、條帶清晰視為完整性良好。

4、病毒核酸檢測(cè)與重復(fù)性驗(yàn)證

陽(yáng)性率檢測(cè)：將提取的核酸樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR（SARS-CoV-2、H1N1）或PCR（AdV-5）檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系（20μL：模板核酸 5μL，酶混合液10μL，引物探針混合液4μL，無(wú)酶水1μL）及反應(yīng)程序（逆轉(zhuǎn)錄：50℃，30min；預(yù)變性：95℃，5min；擴(kuò)增：95℃ 15s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)），Ct值<38視為陽(yáng)性，計(jì)算兩組的陽(yáng)性檢出率。

重復(fù)性驗(yàn)證：選取同一病毒樣本（SARS-CoV-2，病毒載量10? copies/mL），采用博清生物核酸提取儀進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)提取（同批次試劑、同儀器）及3次批間重復(fù)提取（不同批次試劑、不同日期），檢測(cè)核酸濃度并計(jì)算變異系數(shù)（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%），CV<5%視為重復(fù)性良好。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“率（%）”表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）核酸濃度與純度對(duì)比

博清生物組對(duì)3種病毒的核酸提取濃度均顯著高于傳統(tǒng)酚-氯仿組（P<0.05），且所有樣本的A260/A280比值均處于1.8~2.0范圍內(nèi)，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

（二）核酸完整性結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，博清生物提取的3種病毒核酸條帶均清晰明亮，無(wú)明顯彌散或降解條帶；傳統(tǒng)酚-氯仿組條帶亮度較低，部分樣本出現(xiàn)輕微彌散，提示核酸完整性略遜于儀器組。

（三）病毒核酸陽(yáng)性率與重復(fù)性

1、陽(yáng)性率：博清生物組對(duì)SARS-CoV-2、H1N1、AdV-5的核酸陽(yáng)性檢出率均為100%（3/3）；傳統(tǒng)酚-氯仿組中，SARS-CoV-2陽(yáng)性率為83.3%（2/3），H1N1陽(yáng)性率為66.7%（2/3），AdV-5陽(yáng)性率為83.3%（2/3），兩組陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.286，P<0.05）。

2、重復(fù)性：博清生物組的批內(nèi)CV為3.2%，批間CV為4.5%，均<5%，表明儀器提取結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性。

（四）提取效率對(duì)比

博清生物組單次提取16份樣本的總耗時(shí)約為35min（含儀器預(yù)熱）；傳統(tǒng)酚-氯仿組單次提取3份樣本的總耗時(shí)約為90min（不含樣本離心時(shí)間），儀器組效率較傳統(tǒng)方法提升60%以上，且無(wú)需人工反復(fù)操作，降低了人為誤差與污染風(fēng)險(xiǎn)。

三、討論

病毒分離過(guò)程中，核酸提取的效率與質(zhì)量直接決定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性，尤其在低載量病毒樣本或批量樣本處理場(chǎng)景中，提取方法的選擇至關(guān)重要。本研究通過(guò)多維度對(duì)比驗(yàn)證，明確了博清生物核酸提取儀在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在以下三方面：

一、提取效率與純度優(yōu)勢(shì)：博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀采用磁珠法原理，磁珠表面的特異性基團(tuán)可高效結(jié)合病毒核酸，且通過(guò)自動(dòng)化洗滌步驟去除蛋白、鹽類(lèi)等雜質(zhì)，因此提取的核酸濃度顯著高于傳統(tǒng)酚-氯仿法，A260/A280比值更接近理想范圍（1.8~2.0）。這一結(jié)果與磁珠法“高特異性結(jié)合、低雜質(zhì)殘留”的特性一致，可有效避免傳統(tǒng)方法中酚類(lèi)試劑殘留對(duì)后續(xù)PCR反應(yīng)的抑制作用。

二、穩(wěn)定性與安全性優(yōu)勢(shì)：儀器的全自動(dòng)操作減少了人工移液、振蕩等步驟，批內(nèi)、批間CV均<5%，重復(fù)性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法；同時(shí)，封閉式提取通道可降低樣本間交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)病毒學(xué)研究中“避免假陽(yáng)性結(jié)果”尤為重要。此外，儀器提取耗時(shí)僅為傳統(tǒng)方法的40%，可滿足科研中“快速處理批量樣本”的需求，例如疫情期間的病毒分離篩查或突發(fā)病毒的應(yīng)急研究。

三、適用范圍廣：本研究涵蓋了RNA病毒（SARS-CoV-2、H1N1）與DNA病毒（AdV-5），儀器均能實(shí)現(xiàn)高效提取，表明其對(duì)不同類(lèi)型病毒核酸的兼容性良好。后續(xù)可進(jìn)一步拓展至其他病毒（如乙肝病毒、皰疹病毒）或復(fù)雜樣本（如痰液、組織勻漿），驗(yàn)證其在更多科研場(chǎng)景中的適用性。

本研究的局限性在于樣本量較小（每種病毒僅3份樣本），且未涉及極端低載量（<103 copies/mL）病毒樣本的提取驗(yàn)證。未來(lái)可擴(kuò)大樣本量，并結(jié)合數(shù)字PCR等更靈敏的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步優(yōu)化儀器的提取參數(shù)，提升對(duì)低載量病毒樣本的檢出能力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀在病毒學(xué)研究的病毒分離環(huán)節(jié)中，展現(xiàn)出高效、高純度、穩(wěn)定、快速的核酸提取性能，可滿足SARS-CoV-2、甲型流感病毒、腺病毒等不同類(lèi)型病毒的核酸提取需求，為后續(xù)病毒基因檢測(cè)、序列分析及功能研究提供可靠的樣本保障。該儀器可作為病毒學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中核酸提取的優(yōu)選工具，尤其適用于批量樣本或高要求的科研場(chǎng)景，具有較高的推廣應(yīng)用價(jià)值。