隨著工業化與農業集約化發展，重金屬、抗生素、持久性有機污染物等不斷進入環境，通過食物鏈富集、微生物群落結構改變、功能基因水平轉移等途徑，對生態系統穩定性及人類健康構成潛在威脅。生態風險評估作為環境管理的核心環節，需精準識別污染物暴露水平與生態效應的關聯，而傳統監測方法（如微生物培養法、化學儀器分析法）存在明顯局限：培養法僅能檢測可培養微生物，無法反映群落真實功能；化學法雖能定量污染物總量，但難以評估其生物有效性及對微生物代謝功能的影響。
熒光定量PCR（qPCR）技術通過實時監測PCR擴增過程中的熒光信號，實現目標核酸的定量分析，具有靈敏度高、特異性強、檢測周期短等優勢。博清生物科技（南京）有限公司作為國內分子診斷設備領軍企業，其研發的熒光定量PCR儀優化了光學系統與溫控模塊，支持5通道同時檢測，可滿足多靶點同步分析需求，且具備智能化操作界面與數據溯源功能，適合環境樣品的高通量檢測。
一、材料與方法
（一）研究區域與樣品采集
選取3類典型研究區域：
1、工業污染區（IP）：某化工園區廢水排放口下游0-1000m水體及周邊500m農田土壤；
2、農業種植區（AG）：長期施用化肥（N-P-K復合肥）與抗生素類農藥（如四環素類）的農田土壤；
3、對照區（CK）：遠離污染源的自然保護區水體與土壤。
樣品采集方法參照《環境監測技術規范》：
1、水樣：采用有機玻璃采水器采集表層（0.5m）、中層（2m）、底層（4m）水樣，混合后取1L，經0.22μm 聚醚砜濾膜過濾，濾膜置于-20℃保存；
2、土壤樣：采用五點采樣法采集0-20cm表層土壤，每點取100g，混合后過2mm篩，去除雜質，分裝備用（-20℃保存）。每個區域設3個重復采樣點，共采集樣品36份（水體18份、土壤18份）。
（二）儀器與試劑
1、核心儀器：博清生物熒光定量PCR儀；
2、輔助儀器：高速冷凍離心機、超純水儀、核酸提取儀；
3、試劑：土壤/水體微生物DNA提取試劑盒、TaqMan探針qPCR預混液、目標基因特異性引物探針、標準品質粒。
（三）實驗方法
1、樣品前處理與DNA提取
水樣：將冷凍保存的濾膜剪碎，加入裂解液，參照DNA提取試劑盒說明書進行微生物總DNA提取；
土壤樣：稱取0.5g土壤樣品，去除腐殖質后，采用核酸提取儀自動化提取總DNA。提取的DNA檢測純度，瓊脂糖凝膠電泳驗證完整性，-80℃保存備用。
2、qPCR反應體系與程序設置
基于博清生物熒光定量PCR儀，構建20μL qPCR反應體系：10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，探針0.4μL，DNA模板2μL，無酶水6μL。空白對照以無酶水替代模板，每個樣品設3次技術重復。
反應程序：預變性95℃ 3min；變性95℃ 10s，退火延伸60℃ 30s（采集熒光信號），40個循環；溶解曲線分析（60-95℃，升溫速率0.5℃/s）。
3、標準曲線構建與儀器性能驗證
將梯度稀釋的標準品質粒進行qPCR檢測，以標準品濃度的對數為橫坐標，對應的Ct值為縱坐標，構建標準曲線，計算線性相關系數（R2）與擴增效率。
驗證博清生物熒光定量PCR儀的靈敏度（最低檢測限）、重復性（批內、批間Ct值變異系數，CV）與特異性（溶解曲線單峰，無非特異性擴增）。
二、結果與分析
（一）博清生物熒光定量PCR儀性能驗證結果
1、標準曲線與擴增效率
3種目標基因的標準曲線均呈現良好線性關系：cadA基因 R2=0.998，E=98.2%；tetA基因 R2=0.997，E=96.5%；amoA基因R2=0.999，E=101.3%。擴增效率均處于90%-110% 的理想范圍，表明儀器定量準確性滿足環境樣品檢測需求。
2、靈敏度與重復性
博清生物熒光定量PCR儀對3種基因的最低檢測限均達10拷貝/μL，且當模板濃度為10拷貝/μL時，Ct值變異系數<3%（n=3），表明儀器具備高靈敏度。批內重復性試驗中，同一樣品3次重復的Ct值CV為1.2%-1.8%；批間重復性試驗（連續3天檢測）的Ct值CV為1.5%-2.0%，均<2%，證實儀器檢測穩定性優異。
3、特異性
溶解曲線分析顯示，3種目標基因均呈現單一峰值，無引物二聚體或非特異性擴增峰，表明引物探針設計合理，儀器光學系統可精準區分不同熒光信號，特異性良好。
（二）不同區域目標基因豐度分布
1、水體樣品
工業污染區（IP）水體中cadA基因與tetA基因豐度顯著高于對照區（CK）：IP區cadA基因豐度為（2.47×10?±1.23×10?）拷貝/L，是CK區（3.00×10?±2.15×103）的82.3倍；tetA基因豐度為（1.97×10?±1.05×10?）拷貝/L，是CK區（3.00×10?±1.87×103）的65.7倍（P<0.01）。農業種植區（AG）水體中tetA基因豐度為（4.50×10?±2.31×10?）拷貝/L，是CK區的15.0倍（P<0.05），cadA基因豐度與CK區無顯著差異（P>0.05）。
2、土壤樣品
IP區土壤中amoA基因豐度為（1.26×10?±8.50×103）拷貝/g，僅為CK區（4.00×10?±2.50×10?）的31.5%（P<0.01），表明工業污染抑制硝化細菌活性；AG區土壤中tetA基因豐度為（8.40×10?±4.20×10?）拷貝/g，是CK區（6.00×10?±3.10×103）的14.0倍（P<0.01），amoA基因豐度為（2.80×10?±1.50×10?）拷貝/g，顯著低于CK區（P<0.05）。
（三）生態風險評估結果
基于ERI模型計算，不同區域生態風險等級差異顯著：
1、IP區：水體ERI=0.87，土壤ERI=0.82，均為高風險，主要風險源于重金屬與抗生素復合污染導致的抗性基因富集及功能微生物抑制；
2、AG區：土壤ERI=0.52，為中風險，風險貢獻以tetA基因為主（化肥農藥施用導致抗生素抗性基因擴散）；水體ERI=0.28，為低風險；
3、CK區：水體與土壤ERI均<0.3，為低風險，生態系統功能穩定。
三、討論
（一）博清生物熒光定量PCR儀在環境監測中的技術優勢
相較于傳統檢測技術，博清生物熒光定量PCR儀在環境樣品分析中展現三大核心優勢：
1、高靈敏度與定量精度：最低檢測限達10拷貝/μL，可捕獲環境中低豐度抗性基因與功能基因，解決傳統培養法“漏檢”問題；標準曲線R2>0.995，確保基因豐度定量準確，為生態風險評估提供可靠數據基礎；
2、高效性與高通量：支持96孔板與 5通道同步檢測，單批樣品（36份）檢測周期僅需2.5h，較普通PCR（需后續電泳定量）效率提升3-4倍，適合大規模環境普查；
3、智能化與易用性：配備LIMS數據管理系統，可自動生成標準曲線、計算基因豐度及導出報告，減少人為操作誤差；觸摸屏操作界面簡化流程，降低非專業人員使用門檻，便于在基層環境監測站推廣。
（二）生態風險評估結果的環境意義
工業污染區高ERI值表明，重金屬（如鎘）與抗生素（如四環素）的復合暴露可顯著促進抗性基因的水平轉移，而amoA基因豐度降低則意味著硝化作用減弱，可能導致土壤氮循環失衡，進而影響植物生長與水體富營養化進程。農業種植區tetA基因富集提示，抗生素類農藥的不合理使用可能成為抗性基因進入環境的重要途徑，需加強農藥使用管控。
（三）研究局限性與未來方向
本研究僅選取3類目標基因，未來可結合宏基因組學技術，利用博清生物熒光定量PCR儀的多通道優勢，同步檢測更多污染物指示基因，構建更全面的生態風險評估體系；此外，可開展長期動態監測，分析基因豐度變化與生態效應的時間關聯，提升風險預測能力。
博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀具備高靈敏度、高重復性與高特異性，可高效、準確定量環境中的抗性基因與功能基因，滿足環境監測對分子標志物檢測的技術需求。
基于該儀器的檢測數據構建的ERI模型，可有效量化工業污染區、農業種植區的生態風險等級，明確污染來源與風險貢獻因子。
博清生物科技（南京）有限公司研發的熒光定量PCR儀為環境監測與生態風險評估提供了可靠的分子生物學工具，建議在環境管理與科研領域進一步推廣應用，為生態系統保護與污染防控提供技術支撐。
