熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)基于實(shí)時(shí)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)核酸擴(kuò)增過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)病原體的定性與定量分析，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)，已成為現(xiàn)代疫病診斷的核心技術(shù)之一。儀器性能是影響qPCR檢測(cè)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素，需具備精準(zhǔn)的溫度控制（升降溫速率、孔間溫度均一性）、穩(wěn)定的熒光檢測(cè)系統(tǒng)（激發(fā)光強(qiáng)度、信號(hào)采集靈敏度）及便捷的數(shù)據(jù)分析功能。博清生物科技（南京）有限公司作為國(guó)內(nèi)領(lǐng)先的分子診斷設(shè)備研發(fā)企業(yè)，其推出的熒光定量PCR儀在溫度控制精度（±0.3℃）、升降溫速率（最大6℃/s）及熒光通道數(shù)量（5通道）等核心參數(shù)上表現(xiàn)優(yōu)異，但該儀器在畜禽疫病診斷中的實(shí)際應(yīng)用性能尚未系統(tǒng)驗(yàn)證。

一、結(jié)果

（一）靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)3種靶標(biāo)病原體的檢測(cè)靈敏度結(jié)果。該儀器對(duì)CSFV和AIV的最低檢測(cè)限均為10^1 copies/μL，對(duì)牛布魯氏菌的最低檢測(cè)限為10^2CFU/mL；進(jìn)口對(duì)照儀器的檢測(cè)限分別為10^1 copies/μL（CSFV）、10^1 copies/μL（AIV）、10^2 CFU/mL（牛布魯氏菌），兩者靈敏度一致，且均較普通PCR（檢測(cè)限10^3 copies/μL/CFU/mL）提升100倍。

（二）特異性驗(yàn)證結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，博清生物熒光定量PCR儀僅對(duì)CSFV、AIV（H9）、牛布魯氏菌的模板產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線，Ct值在20-30之間；對(duì)PRRSV、NDV、大腸桿菌、沙門氏菌、PCV2的模板均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)（Ct值>40），溶解曲線均為單峰，無(wú)雜峰干擾，表明該儀器檢測(cè)3種靶標(biāo)疫病的特異性達(dá)100%，無(wú)交叉反應(yīng)。

（三）重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)（CV）結(jié)果。博清生物熒光定量PCR儀檢測(cè)高、中、低3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)CV為1.2%-2.8%，批間CV為1.5%-3.0%，均<5%；進(jìn)口對(duì)照儀器的批內(nèi)CV為1.0%-2.5%，批間CV為1.3%-2.7%，兩者穩(wěn)定性無(wú)顯著差異（P>0.05），表明博清生物熒光定量PCR儀檢測(cè)結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

（四）臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

200份臨床疑似樣本的檢測(cè)結(jié)果。博清生物熒光定量PCR儀檢測(cè)CSFV的陽(yáng)性符合率為96.7%（29/30）、陰性符合率為97.1%（49/50）、總符合率為96.9%（78/80）；檢測(cè)AIV（H9）的陽(yáng)性符合率為95.2%（20/21）、陰性符合率為97.9%（47/48）、總符合率為95.7%（67/70）；檢測(cè)牛布魯氏菌的陽(yáng)性符合率為94.4%（17/18）、陰性符合率為97.5%（31/32）、總符合率為96.0%（48/50）。此外，博清生物熒光定量PCR儀單樣本檢測(cè)周期（從核酸提取到結(jié)果分析）為2.0-2.5小時(shí)，而傳統(tǒng)病原分離培養(yǎng)法需3-5天，檢測(cè)效率顯著提升。

二、討論

畜禽疫病的早期精準(zhǔn)診斷是防控工作的核心，而檢測(cè)儀器的性能直接決定診斷效率與準(zhǔn)確性。本研究從方法學(xué)驗(yàn)證與臨床應(yīng)用兩個(gè)維度，系統(tǒng)評(píng)估了博清生物熒光定量PCR儀在畜禽疫病診斷中的價(jià)值，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下三方面：

（一）高靈敏度與特異性，滿足早期診斷需求

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)CSFV、AIV（H9）、牛布魯氏菌的檢測(cè)限低至10^1 copies/μL 或10^2 CFU/mL，可檢出感染早期（如豬瘟病毒感染后24小時(shí)、禽流感病毒感染后12小時(shí)）的低載量樣本，而傳統(tǒng)ELISA方法通常需待病原體載量達(dá)到10^3 copies/μL以上才能檢出。此外，該儀器通過(guò)5通道熒光檢測(cè)與特異性探針設(shè)計(jì)，有效避免了非靶標(biāo)病原體的交叉反應(yīng)，溶解曲線無(wú)雜峰，確保了診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，可減少因假陽(yáng)性導(dǎo)致的“過(guò)度防控”或假陰性導(dǎo)致的“疫病擴(kuò)散”風(fēng)險(xiǎn)。

（二）高穩(wěn)定性與便捷性，適配基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用

基層畜牧獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室是畜禽疫病監(jiān)測(cè)的“第一道防線”，對(duì)儀器的穩(wěn)定性與操作便捷性要求較高。本研究中，博清生物熒光定量PCR儀的批內(nèi)與批間CV均<3%，溫度控制精度達(dá)±0.3℃，即使在連續(xù)高強(qiáng)度檢測(cè)（每日檢測(cè)100份樣本）下，仍能保持結(jié)果穩(wěn)定；其配套的數(shù)據(jù)分析軟件可自動(dòng)生成檢測(cè)報(bào)告（含Ct值、溶解曲線、定量結(jié)果），無(wú)需專業(yè)人員手動(dòng)計(jì)算，操作門檻低于進(jìn)口儀器。此外，該儀器的耗材兼容性強(qiáng)，可適配國(guó)內(nèi)主流品牌的qPCR試劑，檢測(cè)成本較進(jìn)口儀器降低30%-40%，更適合我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)濟(jì)需求。

（三）快速高效，支撐應(yīng)急防控決策

在畜禽疫病暴發(fā)場(chǎng)景中，檢測(cè)速度直接影響防控措施的時(shí)效性。博清生物熒光定量PCR儀的單樣本檢測(cè)周期僅2.5小時(shí)，可實(shí)現(xiàn)“樣本接收-結(jié)果報(bào)告”的當(dāng)日完成，而傳統(tǒng)病原分離培養(yǎng)法需3-5天，易錯(cuò)過(guò)最佳防控窗口。例如，在本研究中某規(guī)模化豬場(chǎng)的疑似豬瘟樣本檢測(cè)中，博清儀器在2小時(shí)內(nèi)確診12份陽(yáng)性樣本，養(yǎng)殖場(chǎng)據(jù)此及時(shí)隔離病豬、消毒環(huán)境，將疫情控制在單個(gè)豬舍內(nèi)，避免了全群感染；若采用傳統(tǒng)方法，可能導(dǎo)致疫情擴(kuò)散，經(jīng)濟(jì)損失增加50%以上。

本研究仍存在一定局限性：僅針對(duì)3種常見(jiàn)畜禽疫病建立了檢測(cè)方法，后續(xù)需擴(kuò)展至豬藍(lán)耳病、禽新城疫、牛結(jié)核病等更多疫病；臨床樣本來(lái)源集中于華北、華東地區(qū)，需在全國(guó)范圍內(nèi)擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證儀器的區(qū)域適用性。此外，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于該儀器的“多重qPCR檢測(cè)方法”，實(shí)現(xiàn)單管同時(shí)檢測(cè)多種病原體，提升檢測(cè)效率。

本研究證實(shí)，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在畜禽疫病診斷中具備高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性及快速高效的優(yōu)勢(shì)，其性能與進(jìn)口同類儀器相當(dāng)，且在成本控制與操作便捷性上更具競(jìng)爭(zhēng)力。該儀器可有效應(yīng)用于豬瘟、禽流感、布魯氏菌病等畜禽疫病的早期診斷、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及應(yīng)急防控，為農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)領(lǐng)域的畜禽疫病防控提供可靠技術(shù)支撐，對(duì)保障我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展與公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

未來(lái)可通過(guò)拓展檢測(cè)病種、開(kāi)發(fā)多重檢測(cè)方法、優(yōu)化基層應(yīng)用流程等方式，進(jìn)一步發(fā)揮博清生物熒光定量PCR儀的應(yīng)用價(jià)值，推動(dòng)我國(guó)畜禽疫病診斷技術(shù)向“國(guó)產(chǎn)化、精準(zhǔn)化、高效化”方向發(fā)展。